АНАЛИЗ СПОСОБОВ СРАВНЕНИЯ СКОРОСТИ ПОЧКОВАНИЯ ДРОЖЖЕЙ, ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК, ДРОБЛЕНИЯ ЯИЦ

Б. П. Токин

Из отд. механики развитии Биол. ин-та им. К. А. Тимирязева

Давно назрела необходимость анализа способов сравнения скорости почкования дрожжей, деления клеток, дробления яиц. Этого требует практика биологического исследования. Особенную остроту вопрос об объективных показателях, критериях ускорения или замедления размножения клеток имеет в работах по стимуляции размножения, в исследованиях по вопросам о причинах и условиях процесса клеточного деления.

Но этот вопрос стоит с достаточной остротой не только в теоретических биологических исследованиях. Он занимает большое место в практике медицинского исследования, в ряде биологических задач в области промышленности и т. д.; этот вопрос естественно играет большую роль во всех тех работах, где приходится делать сравнения скорости размножения организмов. Так, в патологоанатомическом исследовании очень важную роль играет определение относительной скорости размножения, напр., раковых клеток.

Казалось бы этот чисто технический вопрос сравнительно просто разрешается в каждом отдельном случае. Обычно биологи не чувствуют необходимости теоретического анализа подобного рода технических приемов исследования. Однако это большое заблуждение. Конечно вопрос о сравнительной скорости развития яиц животных в случае, когда дробление всей массы яиц происходит синхронно, разрешается достаточно просто. Никаких затруднений мы не испытываем, напр., в сравнении относительной скорости дробления яиц Ascaris megalocephala. Здесь яйца, взятые из одного участка гонады, при нормальных условиях развития проделывают последовательный эмбриональный цикл практически одновременно. И если мы у одной порции этих яиц под влиянием какого-либо рода стимулирующего фактора, напр., температуры, имеем развитие до стадии 24 бластомер, а контрольная порция яиц из той же гонады показывает стадию 8 бластомер, — мы делаем заключение о более быстром развитии первой порции яиц. Здесь могут встать перед вами свои специфические трудности. Так, напр., не всегда ускорение на определенных стадиях означает ускорение всего цикла дробления. Может возникнуть еще большей важности принципиальный вопрос, считать ли действительной стимуляцией развития те случаи, когда мы имеем ускорение во времени процесса развития, но все бластомеры или образовавшаяся личинка червя будут иметь значительно меньшие размеры, чем контрольный материал. Но эти вопросы нас сейчас не интересуют.

Итак, в случае яиц аскариды учет скоростей развития представляется весьма простым. Так же просто обстоит вопрос и отношении яиц морских ежей. Но уже совсем другое дело, напр., яйца различных видов моллюска. Их яйца дробятся несинхронно. Яйца одной и той же кладки дают обычно картину, достаточно пеструю в отношении стадии развития.

Куда сложнее обстоит вопрос с учетом сравнительной скорости размножения простейших, размножения клеток многоклеточных организмов. Этот вопрос далеко не элементарен и некоторыми биологами он разрешается неправильно. Неправильное разрешение его ведет часто к неверным теоретическим выводам, обобщениям.

Иллюстрируем важность этого вопроса на материале школы А. Г. Гурвича и других школ, занятых проблемой митогенетического излучения.

Наши исследования еще не закончены. Ставится ряд экспериментов для обоснования развиваемых мыслей. Но уже в настоящее время мы считаем возможным в предварительной форме развить ряд мыслей.

Все работы по митогенетическим лучам в отношении интересующего нас вопроса можно разбить на три группы.

К первой группе принадлежат работы Л. Б. Северцевой (8) по митогенетическому воздействию на бактерии, где эффект воздействия учитывается бактериологическим способом подсчета абсолютного числа особей. К этому же типу работ принадлежит т. н. объемный и нефолометрический способы, разработанные на дрожжах. К этому же типу работ принадлежат исследования Максиа (Maxia) (4) над развивающимися яйцами морских животных, исследования Залкинда-Потоцкой, Цоглиной (5) над развитием яиц морских архианнелид (Soccocirus Protodrilus) и некоторые другие работы.

Суть всех этих работ в отношении техники учета сравнительной скорости размножения аналогична работе Северцевой. Здесь также производится учет влияния митогенетических лучей по числу особей: учитывается число яиц, находящихся на разных стадиях дробления, увеличение числа яиц, "приступающих"  к развитию, изучается появление уродств отдельных особей и т. д.

Вторую группу опытов составляют такие, в которых производится учет развития какой-либо ткани, органов микроскопически или макроскопически. Такова принципиальная суть техники работ, напр., Бляхера (2) с головастиками лягушки, когда производится учет относительной скорости развития почек передних конечностей при метаморфозе головастиков Rana temporaria.

Как ни значителен накопленный материал по митогенетическим лучам с перечисленными выше техническими приемами, он все же в известном смысле случаен, эпизодичен, пестр. Все это — одиночные исследования, проведенные для разрешения частных конкретных вопросов митогенетических лучей.

Главная масса опытов, позволившая А. Г. Гурвичу и всем его последователям сделать основные решающие выводы по проблеме митогенетического излучения, проведена таким образом, что учет сравнительной скорости размножения облученного и контрольного материала производился вычислениями количества митозов, находящихся на определенной стадии, или сравнением (в опытном и контрольном материалах) процентного отношения почек определенного размера ко всем другим формам.

В своей работе "Митогенетическое излучение" (3) А. Г. Гурвич говорит с совершенной отчетливостью об основной по существу роли "дрожжевой методики"  в работах по митогенетическим лучам.

Так, Л. Г. Гурвич пишет: "Так как данные опытов, полученные с помощью дрожжевых культур в нашей и в некоторых других лабораториях, лежат в основе учения и дальнейших исследований, то мы считаем необходимым проанализировать надежность метода самым исчерпывающим и скрупулезным образом".

Действительно все основные выводы, сама, так сказать, теория митогенетического излучения получена на корешках лука и еще в большей степени на дрожжах.

Сюда относится само доказательство существования митогенетических лучей ("основной опыт" Гурвича, мутоиндукция дрожжей), теория вторичного излучения, теория митогенетического угнетения, опыты с фракционированной подачей митогенетического излучения и т. д.

Не будет ошибкой сказать, что из этих двух объектов — лук и дрожжи — пальма первенства уже давно принадлежит дрожжам. Франк и Залкинд в своей книге "Митогенетические лучи" (6) пишут: „Действительно быстрым развитием проблемы митогенетических лучей в последнее время и нахождением целого ряда новых фундаментальных фактов мы обязаны применению разработанной М. А. Бароном "дрожжевой методики" (1).

Напомним основные моменты этой методики. Ровно засеянные дрожжи (обычно брались Nadsonia fulvescens) на агар-агаре с пивным суслом уже через 4-6-7 часов годны в качестве детектора.

Агаровая пластинка разрезается на необходимое число по возможности одинаковых блоков. Часть их может быть подвергнута митогенетическому воздействию. Один или несколько блоков идут в качестве контроля.

Время экспозиции — в зависимости от задачи исследования. Но при всех вариациях экспозиции дается возможность проявления митогенетического эффекта; это достигается тем, что дрожжи фиксируются не тотчас после экспозиции, а через 1 час. 30 мин., через 1 час. 40 мин. или через 2 часа. Есть основание считать, что достаточно для этого и 1 часа. Берутся пробы. Фиксированные и окрашенные дрожжи рассматриваются при большом увеличении микроскопа.

Сравнение процента почек в контроле и опытном материале дает возможность судить об относительной скорости почкования. Но так как в препарате мы имеем естественно все градации величины почек, находящихся на разных стадиях развития, в школе А. Г. Гурвича следуют правилу: подсчитывать почки не всех размеров, а лишь почки определенной величины, именно те, размер которых не более ¹/3 или ¹/4 материнской клетки. Подсчитывается не абсолютное число почек, а процентное отношение почек определенного размера ко всем другим формам (к отдельным особям и почкам других размеров).

Приведем числовые примеры. Положим, что на каждую тысячу "взрослых" клеток (в контроле) приходится 90 почек, размером менее ¹/₃ материнской клетки. Значит процент почкования равен 9. Положим в опытном материале мы имеем соответственно или 9%, или 10%, или 8%.

Все приведенные случайно цифры показывают, что налицо нет митогенетического эффекта, т. к. такого типа вариации в числе почек могут быть и в нормально, без митогенетического воздействия, растущей культуре. По ряду причин условились считать, что имеется налицо изменение в скорости почкования, если т. н. индукционный процент более 20.

Таким образом, напр., если в контрольном блоке —  9%, а в опытном — 12%, то разность составит 12 — 9, т. е. 3. Индукционный процент будет равен  ^3*100/₉, т. е. 33,3%. Это уже считается показателем наличия митогенетического эффекта, т. е. ускорения размножения клеток.

Техника учета скорости почкования рядом авторов была встречена скептически и до сих пор не разделяется некоторыми. Основные возражения идут гл. обр. по линии опасности субъективной оценки величины почек. Часто трудно бывает определить, считать ли данную почку за почку, меньшую ¹/₃ материнской; имеем ли мы дело с небольшой почкой или в поле зрения — морфологически несколько сходный остаток на материнской клетке отпочковавшейся клетки и т. д.

Подобные опасения и вся критика методики М. Барона по этой линии нам кажутся лишенными серьезных оснований. Мы должны целиком согласиться с А. Г. Гурвичем и всеми, использующими дрожжевую методику М. Барона, в том, что субъективизм в подсчете числа почек не может здесь играть сколько-нибудь существенной роли. Многочисленные подсчеты почек дрожжей в наших исследованиях (6, 7) говорят также за неосновательность тревоги по этой линии.

C этой стороны нам кажутся основанными на недоразумении результаты опытов Шрейбера и Накадзуми (7).

На основании своих исследований они делают заключение о непригодности дрожжей в качестве детектора. У них получаются очень значительные вариации числа почек в контроле; подсчет одного и того же препарата разными лицами дает разную картину и т. д.

Для нас совершенно ясно, что авторы введены в заблуждение какой-то неточностью самой постановки опытов. Если делать хорошие ровные во всех частях поверхности агарового блока засевы, если тщательно производить подсчет числа клеток, не будет никаких оснований опасаться получить случайные результаты опытов.

Кстати способ шифрования стекол, сочетающийся с двойным пересчетом шифрованных препаратов одним и тем же лицом, гарантирует всегда от ошибок. Подчеркиваем, что пересчет должен проводиться одним и тем же лицом, т. к. естественно, что если одни препараты, положим контрольные, считает один работник, другие же препараты — опытные — другой работник, некоторая неизбежная субъективность оценки величины почек может привести к нежелательным результатам.

Таким образом для нас должно быть совершенно очевидно, что возражения, сомнения по этой линии неосновательны.

Но дрожжевая методика учета митогенетического эффекта, на которой построено, в значительной мере современное здание теории митогенетических лучей, не свободна от возражений. Более того на основании анализа вопроса, анализа материала, даваемого самой школой А. Г. Гурвича, мы можем заключить, что бароновская дрожжевая методика на самом деле не дает действительного представления об имеющих место процессах и должна быть подвергнута самому терпеливому, глубокому теоретическому анализу или совершенно оставлена в практике исследования.

Попытаемся вчерне показать это, оставив изложение всей необходимой полноты анализа и экспериментальных данных до специальной работы.

Как известно, в школе А. Г. Гурвича сущность митогенетического воздействия до самого последнего времени заключалась в сокращении периода покоя между двумя последовательными делениями одной клетки

А. Г. Гурвич несмотря на некоторые противоречивые высказывания в различных работах все же считал до самого последнего времени, что сущность митогенетического индукционного воздействия заключается в ускорении подготовки клеток к делению, в данном случае к почкованию дрожжей.

В самое последнее время, начиная с 1932 г. (с опубликования книги Гурвича: „Митогенетическое излучение“) мы имеем уже серьезные попытки присмотреться к своей методике. Правда, как увидим далее, пока критика своего метода очень робка и нерешительна: оставляется незыблемым весь материал, построенный на основе методики М. Барона, и т. д.

Начнем с элементарных рассуждений в целях выяснения вопроса, что может означать, положим, преобладание по сравнению с контролем на 3—6 и т. д. процентов почек после воздействия митогенетическими лучами.

Первое элементарное правило состоит в том, что нужно не выхватывать "импонирующие",  "удобные" исследователю моменты развития и на основании их судить о всем процессе, а попытаться найти действительно решающие моменты.

. Кажется в высшей степени странной полная произвольность в выборе моментов для учета скорости почкования. Почему берутся почки, менее ¹/3 материнской клетки? Чтобы решиться на этот шаг, нужно было доказать, что увеличение числа почек этого размера является показателем ускорения развития, ускорения почкования. Мы не находим этого в ранних работах школы Гурвича. Защита 6ароновского метода в последних работах нас убедить не может.

Попробуем проанализировать этот вопрос. Мы должны исходить из факта, что в любом препарате дрожжей, нормально развивающихся, мы имеем самые разнообразные стадии развития, начиная от дрожжей и стадии „покоя", дрожжей, готовых к почкованию, кончая самыми поздними стадиями почкований. Какую же стадию почкования взять для учета ускорения или замедления почкования?

Здесь несколько возможностей, но отнюдь не произвольных.

Первая возможность: все стадии почкования и развития дрожжинки ускоряются в одинаковой мере под влиянием того или иного агента, напр., митогенетического луча.

Вторая возможность: ускоряется развитие какой-либо одной стадии или нескольких, а скорость других стадий развития остается прежней. Нетрудно видеть, что к этому типу относится, хотя и не совсем доказано, одно из предположений Гурвича о том, что митогенетический луч ускоряет подготовку клетки к почкованию.

Могут быть, конечно, самые различные иные, столь же вероятные биологические предположения. Напр., возможно, что ускоряются определенные стадии развития и замедляются в свою очередь иные. Можно думать, что некоторые агенты влияют на скорость отрыва готовой почки от материнского организма и т. д. Решить эти вопросы можно лишь при том условии, когда путем тщательного теоретического анализа будет найден действительный показатель ускорения деления клеток.

Пока же могут быть самые разнообразные спекулятивные построения с меньшей или большей долей вероятности. Особенно, если принять в расчет, что то, что считается, "покоем" клетки, является по существу очень беспокойной стадией, когда разыгрываются разнообразные процессы жизнедеятельности клетки, с которыми неразрывно связана "подготовка" клетки к почкованию. Эта стадия "покоя" только благодаря нашим еще сравнительно бедным знаниям биологии почкования мыслится как нечто целостное, а не дифференцируется в свою очередь на отдельные стадии.

Не будем анализировать все возможности, которые могут здесь иметь место. Это было бы по существу бесплодно, да и невозможно. Остановимся на первых двух возможностях.

Итак, положим, что сущность митогенетического воздействия заключается в том, что все стадии развития, "покоящейся" дрожжинки и все стадии почкования дрожжей ускоряются в одинаковой мере. Это и было бы бесспорное ускорение развития, бесспорная стимуляция размножения. Но нетрудно видеть, что учесть скорость такого развития бароновским методом абсолютно невозможно.

Гурвич в своей книге "Митогенетическое излучение" говорит: "Если замедление ритма деления пропорционально во всех этапах и пропорционально промежутку времени между делениями, то конечно процентное отношение почек данного калибра ко всем клеткам остается без изменения". Это абсолютно правильно. Только те же рассуждения применимы и к случаю действительной стимуляции развития. Снова встает вопрос, что означают изменения в процентных отношениях, регистрируемые школой А. Г. Гурвича? Не зависят ли они от времени фиксации и т. д.? Почему дается работникам в самой школе А. Г. Гурвича и в других школах произвольно выбирать время для фиксации — от часа до двух, после экспозиции.

Возвратимся однако к первому предположению. Положим, у нас имеется в данной культуре а+b+с+d+e+f клеток, причем а, f и т. д. соответственно обозначают число дрожжевых клеток на определенных стадиях развития. Тогда отношение числа почкующихся форм, напр., стадии с ко всем формам будет ^с/_{а+b+с+d+e+f} . Если мы имеем случай действительного ускорения развития дрожжевых клеток, причем ускорение, равномерно захватывающее все стадии, то отношение  ^с1/_{а1+b1+с1+d1+e1+f1}  будет равно первому отношению.

Какие бы вершины ни предполагать (положим все стадии развития ускоряются в два раза, или замедляются в три раза и т. п.), при условии если брать целые циклы развития, мы получим естественно одно и то же отношение.

Предварительный математический анализ показывает, что приведенные рассуждения правильны, если брать в расчет целые циклы.

Известен факт относительного постоянства цифр отношений почек определенного размера к другим формам (в контроле) в любом моменте наблюдения и в сравнительно разных условиях (свет, температура и т. д.).

Этот факт не имеет еще своего объяснения. Если предположить, что все клетки в культуре равноценны в смысле деления, имеют по времени одинаковый цикл (не абсолютно одинаковый, а имеют отклонения только по закону вариационной кривой), то математический анализ показывает, что в зависимости от момента наблюдения должны получаться разные отношения. Но этому противоречит фактический материал. Надо предполагать, что это относительное постоянство объясняется биологическими закономерностями (пока не выясненными) взаимодействия клеток друг с другом и что эффект сдвига в отношениях под влиянием какого-либо фактора, напр., митогенетического луча, зависит от нарушения этого взаимодействия.

Таким образом бесспорно, что бароновский способ учета не может дать действительного представления об ускорении или замедлении в развитии, если оно захватывает по времени равномерно все стадии развития клетки. Значит то, что мы имеем в работах по митогенетическим лучам, — перевесы процента почек в том или ином случае облучения, — показывает какую-то иную вариацию воздействия.

Обратимся ко второму положению: митогенетический луч или вообще какой-либо стимулирующий агент вызывает ускорение развития определенной стадии почкования дрожжей или "подготовки" к почкованию. Для предварительной ориентировки произведем элементарные арифметические вычисления.

Положим, для простоты, мы имеем перед началом опыта митогенетического воздействия 100 клеток, готовых к почкованию, т. е. которые дадут уже в начале опыта почки, и эти почки в течение 15—20 мин. вырастут до размера одной трети материнской клетки. Положим далее, что в культуре мы имеем 200 клеток таких, которые будут готовы к почкованию, напр., через час. Но предположим, что аналогичные этим 200 клетки в опытном материале благодаря воздействию митогенетических лучей дадут почки не через час, а через полчаса. Воздействуем митогенетическими лучами и фиксируем через час. Какую картину мы будем иметь?

Первые 100 клеток как в опытном, так и в контрольном материале дадут уже через 50 мин. почки такого размера, которые не будут подсчитаны наблюдателем. Вторые 200 клеток в контрольном материале по нашим условиям все дадут к моменту фиксации почки, годные для подсчета. А в опытном материале вследствие ускорения подготовки к почкованию эти 200 клеток уже через полчаса после экспозиции дадут почки, а еще через 15—20 мни., т. е. через 45—50 мин. после начала опыта, дадут почки размером до 1/3 материнской клетки, т. е. к моменту просмотра материала совершенно ускользнут от экспериментатора. В итоге в контрольном материале мы будем иметь Х почкующихся форм на данной стадии, а в опытном материале X—200, т. е. меньше. Любой исследователь, пользующийся бароновским методом, сказал бы: мы имеем здесь случай торможения почкования, случай "митогенетического угнетения" и т. д., т. е. представил бы действительность в совершенно извращенном виде.

На самом же деле в данном случае при меньшем числе почек в опытном материале мы имеем действительную стимуляцию определенных стадий развития, иначе говоря пониженный процент почек на данной стадии является отображением ускорения определенной предшествующей ей стадии.

Нетрудно понять, что обратная картина — увеличение числа почек на определенной стадии в опытном материале при наших заданных условиях — есть отображение торможения развития какой-либо другой предшествующей стадии. А так как в большинстве случаев работники по митогенетическим лучам описывают увеличенное число почек, то это находит с точки зрения принятых условий арифметической задачи объяснение в торможении каких-либо стадий под влиянием того, что называется митогенетическим излучением, и наоборот, все случаи зарегистрированного этим способом „митогенетического угнетения“ означают ускорение развития на определенных стадиях почкования или "подготовки" клетки к почкованию.

Только при очень сложных биологических и математических построениях мы можем попасть на соответствие увеличения (или уменьшения) процентного отношения почек определенного размера к другим формам и увеличения (или соответственно уменьшения) скорости почкования.

Последнее время принесло нам и экспериментальные подтверждения правильности наших рассуждений. Нас тем более радует, что эти экспериментальные подтверждения даются самой школой А. Г. Гурвича. Мы считаем весьма ярким местом в книге Гурвича "Митогенетическое излучение" приведение результата экспериментов Залкинда (стр. 211 немецкого издания и стр. 158 советского издания).

Залкинд одновременно с определением отношения числа почек, размерами меньших  ¹/₃  материнской клетки, к числу взрослых форм вычислял через определенные промежутки времени и абсолютное число клеток.

Несмотря на небольшое число опытов результаты оказались в высшей степени показательными. Только одни эти опыты Залкинда заставляют совершенно по-иному взглянуть на весь материал школы Гурвича, добытый на дрожжах.

Первый вывод напрашивается сам собой, эффект почкования в большинстве случаен не соответствует эффекту размножения.

Сгруппируем весь опубликованный материал по следующим рубрикам: 1. Эффект почкования и эффект размножения положительны, т. е., оба более 20%.  2. Эффект почкования и размножения — оба менее 20%. 3. Эффект почковании менее 20% или даже отрицательный, в то время как эффект размножения более 20%, т. е. положительный. 4. Эффект почкования более 20%, т. е. положительный, в то время как эффект размножения менее 20% или даже отрицательный.

Перед нами только одна техническая трудность. Из таблицы видно, что Залкинд в одних случаях подсчитывал через определенный промежуток времени число почек и абсолютное число клеток, в других же случаях он не дает этих сравнительных цифр, а интересуется лишь динамикой эффекта почкования или эффекта размножения. Нас интересуют только первые случаи (они в таблице намечены звездочкой).

Весь материал распределяется по нашим рубрикам таким образом. К 1-й рубрике относится всего 1 сл. Ко 2-й рубрике относится 0 сл., к 3-й — 13 сл., к 4-й — 4 сл. и наконец 1 сл. стоит особняком: эффект почкования явно отрицателен (—46%), а эффект размножения равен нулю (6%).

Итак общий вывод напрашивается сам собой: обычно мы имеем обратно пропорциональную зависимость между цифрами, выражающими эффект почкования и эффект размножения. Лишь 1 случай показывает соответствие положительного эффекта почкования положительному эффекту размножения.

Если выразить графически данные Залкинда, то в случае правильного предположения об обратной пропорциональной зависимости обоих эффектов (на оси абсцисс нанести цифры, соответствующие эффекту почкования, а на оси ординат — цифры, соответствующие эффекту размножения), то мы должны получить гиперболу. Так оно и есть на самом деле. Конечно получаемая кривая не идеальна, но гиперболический характер ее достаточно отчетлив.

А. Г. Гурвич не смущается результатами опыта Залкинда, а дает новые гипотезы, в которые и должны уложиться вновь полученные факты. В новых рассуждениях А. Г. Гурвича накопляется не менее, а еще более противоречий уже не технического свойства, а касающихся существа проблемы митогенетического излучения.

Гурвич принужден писать: "Первоначальная простая формулировка митогенетического эффекта, с которой мы имели дело в первом томе, где единственным детектором является луковый корешок и единственным эффектом — перевес числа митозов на облученной стороне, в настоящее время очень усложняется и оказывается недостаточной".

"Митогенетические эффекты" можно классифицировать с различных точек зрения: во-первых — по детекторам, не принимая в соображение получаемого на них эффекта; во-вторых, исходя из характера самого эффекта, независимо от того, на каком детекторе он получен. Мы считаем второй путь более подходящим для общего обзора.

Чисто внешне можно различать эффекты митогенетического облучения: А) увеличение числа, одновременно делящихся клеток внутри одного клеточного комплекса (сравнительно с соответственным контролем); Б) повышение интенсивности клеточного размножения в облученном комплексе; В) депрессия клеточного комплекса, выражающаяся в эффекте, противоположном А и Б. и т. д. Приводится еще пять возможных эффектов.

Мы не будем сейчас разбираться во всех этих положениях. Необходимо лишь обратить внимание на условность, произвольность, небиологичность, так сказать, всей этой классификации.

Пункты А и Б навеяны несомненно уже опытами типа Залкинда. Гурвич пишет: "Эффект почкования дает нам неполное представление о том, что происходит в действительности". Чтобы согласовать факты, постулируется мысль: "Мы уже убедились, что первоначальная концепция митогенетического эффекта как импульса к преждевременному делению оказалась слишком узкой и должна быть заменена более широкой и общей."

Эта более "широкая" точка зрения означает лишь новые противоречивые предположения. Так, когда материал укладывается в схему, по которой митогенетический луч вызывает преждевременное почкование, сущность митогенетического воздействия оказывается импульсом преждевременного деления. Если материал не укладывается в эту схему, то митогенетический луч наделяется свойством ускорять рост почек и т. д.

Остановимся более подробно на изложении и оценке новых предположений А. Г. Гурвича и приведем все его решающие принципиальные рассуждения по интересующему нас вопросу.

А. Г. Гурвич пишет:

"Они (Залкинд и Потоцкая. Б. Т.) установили при помощи очень простой методики на жидких дрожжевых культурах наряду с обычным эффектом (увеличение числа почек) и увеличение числа индивидуумов (эффект интенсивности), причем получается своеобразный, на первый взгляд, результат, что в зависимости от условий опыта оба эффекта могут быть или однозначны или идти наперерез друг другу.

В зависимости от источника излучения и времени экспозиции получаются при этом следующие комбинации результатов: 1) положительный эффект почкования, в то время как эффект размножения равен нулю; 2) оба эти эффекта положительны (увеличение числа почек и числа индивидуумов в индуцированной культуре); 3) эффект почкования отрицательный (дефицит почек), эффект размножения положительный (кажущаяся депрессия); 4) оба эффекта отрицательны (уменьшение числа индивидуумов) — истинная депрессия.

Первая комбинация наводит на следующие соображения: если отбросить мало

вероятную возможность, что побужденные к преждевременному почкованию клетки в большинстве абортируют, т. е. начавшееся почкование не доходит до конца и не приводит к размножению индивидуумов, то совершенно ясно, что эффект почкования рано или поздно должен привести и к увеличению числа индивидуумов, т. е. к эффекту размножения. Однако следует принять во внимание и следующие обстоятельства: эффект почкования определяется из формулы  ^(u—К)/_k , где u — процентное отношение почек на индуцированной культуре, К — на контрольной. Если представать себе обычный эффект 30—40%, то он будет, напр., вытекать из 14% почек на индуцированной культуре и из 10% почек на контрольной. Если бы эффект индукции этим и ограничился, то можно было бы ожидать, что по прошествии приблизительно 2 часов из этих сверхсметных почек образуется такое же число лишних индивидуумов, т. е. индуцированная культура окажется на 3—4% богаче клетками, чем контрольная. Такой эффект не может быть с достоверностью обнаружен, так как он находится еще в пределе ошибки метода. Таким образом заранее совершенно нельзя исключить возможности эффекта почкования, не сопровождающегося эффектом размножения. Однако при ближайшем рассмотрении оказывается, что дело обстоит совсем не так. Эффект почкования, подсчитываемый нашим обычным способом, дает нам неполное представление о том, что происходит в действительности. Необходимо выяснить всю кривую аффекта по времени, что было произведено нами в нескольких ориентировочных опытах на корешках и в обширном исследовании Кураева на дрожжах. Эффект индукции на корешках может быть обнаружен, как показал Рузинов и, как нашли на основании своего, отличного от нашего критерия, Рейтер и Габор, уже через 1 час после окончания индукции (возможно, что и раньше) и продолжается но крайней мере еще 5 час. после индукции.

Исследованиями Кураева установлен для агаровых дрожжевых культур промежуток времени эффекта между 30 мин. и 2—2,5 часа.

Для оценки значения этих данных необходимо принять во внимание следующее. При подсчете учитываются, конечно, различные калибры почек, причем можно принять, что если расположить их по возрасту, то мы имеем дело приблизительно с продолжительностью в 15—20 мин. Таким образом, на протяжении 2—2,5 часа, во время которых мы получаем приблизительно одинаковый, даже, строго говоря, нарастающий эффект, мы можем в грубом приближении принять, что сменяется 8—10 поколений учитываемых почек, т. е. индукционный эффект (u—К), поддающийся учету (напр., 14—10%), равен в действительности 30—40%. Таким образом, после того как образовавшиеся в результате индукции сверхсметные почки превратились в клетки, мы в результате эффекта почкования должны получить также и эффект размножения. Понятно однако, что по времени оба эти эффекта не будут совпадать, а второй должен наступить значительно позднее. Таким образом, в том случае, когда эффект индукции распространяется непосредственно лишь на стимуляцию к преждевременному почкованию, вполне естественно ожидать при положительном эффекте почкования одновременно нулевой эффект размножения, т.е. первую из перечисленных выше комбинаций. Но существуют также условия опыта, при которых оба эффекта наступают одновременно.

Если через час после окончания индукции мы находим значительный эффект размножения одновременно с эффектом почкования, то следует сделать вывод, что митогенетическая индукция вызывала не только преждевременное почкование, но также и ускорение роста почек. Это заключение обязательно в силу следующих соображений: нормальный цикл развития дрожжевой клетки длится в среднем 1,5 часа, во всяком случае, не менее часа. Поэтому на основании одного лишь преждевременного вступления некоторого числа клеток к почкованию без соответственного ускорения самого ритма образования новых индивидуумов не могло бы быть уже заметного прироста количества клеток через час после индукции. В тех случаях, где это наблюдается (и достигает значительной степени — 20-30% общего числа), совершенно очевидно имеет место заметное ускорение процесса почкования, и благодаря этому в индуцированной культуре образуются в большинстве уже готовые индивидуумы, в то время как одновременно с ним приступившие к почкованию клетки контрольной культуры еще находятся на полпути своего развития.

Совпадение по времени обоих эффектов может быть достигнуто лишь более длительной экспозицией, чем при одном лишь эффекте почкования. Из этого можно заключить, что порог времени для эффекта деления выше, чем для импульса к преждевременному почкованию.

При еще более длительном облучении наступает третья из упомянутых выше комбинаций: эффект почкования исчезает или даже заменяется дефицитом в почках и одновременно с этим сохраняется или даже усиливается эффект размножения. Объяснение этой комбинации может быть дано на основании выведенных уже нами общих положений.

Обратим внимание сейчас на следующие обстоятельства.

1. Следуя ходу своего анализа. А. Г. Гурвич принужден сказать, что эффект почкования, подсчитываемый нашим обычным способом, дает нам неполное представление о том, что происходит в действительности.

На основании уже изложенных нами мыслей мы должны признать, что речь идет не о неполном представлении, а о том. что эффект почкования, учитываемый обычным способом, давал неверное представление о том, что происходит в действительности, что есть все основания к пересмотру всего накопленного материала и совершенно иной его оценке.

Достаточно напомнить А. Г. Гурвичу о тех работах, в которых регистрировались положим случаи "митогенетического угнетения".

Иллюстрируем примером. В книге Гурвича "Митогенетическое излучение" имеется таблица 189, приводимая нами ниже (табл. 4).

Спрашивается, что означают приводимые здесь цифры? Что означают они даже не с нашей точки зрения, а с точки зрения Л. Г. Гурвича? Он ведь устанавливает четыре возможности. Из них могут быть случаи, когда эффект почкования отрицательный (дефицит почек), а эффект размножении положительный (кажущаяся депрессия); могут быть случаи, когда оба эффекта отрицательны (уменьшение числа индивидуумов) — истинная депрессия.

В приведенной таблице значатся цифры эффекта индукции — 38% и 40%. К какой рубрике отнести эти цифры? Что они означают? Здесь, как и во всех опытах до экспериментов Залкинда, не учитывался эффект размножения.

Означают ли цифры 38—40% "истинную депрессию" или "кажущуюся депрессию", или еще какой-либо феномен? Это решить невозможно. Но не ясно ли, что мы имеем все основания сомневаться в выводах, которые сделаны А. Г. Гурвичем из этих цифр? Те же сомнении мы естественно должны отнести и ко всему аналогичному материалу.

2. Гурвич пишет, что если через час после окончания индукции мы находим значительный эффект размножения одновременно с эффектом почкования, то следует сделать вывод, что митогенетическая индукция вызывала не только преждевременное почкование, но также и ускорение роста почек.

Здесь две стороны вопроса. Один — большой принципиальной важности: А. Г. Гурвич от первоначальной концепции митогенетического луча как фактора, вызывающего преждевременное почкование, деление клеток, переходит к новой гипотезе, по которой в одних случаях митогенетический луч вызывает по-прежнему лишь преждевременное почкование, в других случаях сущность митогенетического воздействия сказывается не только в этом эффекте, но и в ускорении роста почек.

C другой стороны, если митогенетический эффект сказывается и в ускорении подготовки клетки к почкованию, т. е. укорачивает стадию покоя, и в ускорении самого процесса почкования, то, как помнит читатель ход наших рассуждений, в этом случае процентное отношение данного калибра почек ко всем взрослым формам остается одинаковым. Даже если предположить, что ускорение не абсолютно равномерно в отношении всех стадий, все равно мы получим примерно одинаковые цифры. Или отношение может меняться в зависимости от отношения ускорения стадии собственно почкования ко всему циклу развития.

3.Несмотря на эти и имеющиеся другие противоречия приведенная выдержка как показатель начавшегося глубокого критического отношения к господствующей до сего времени методике нас должна весьма радовать.

В другом месте А. Г. Гурвич пишет:

"Число почек есть функция от двух переменных: длительности процесса почкования (темпа роста почек) и количества единовременно приступающих к почкованию клеток, причем в первом случае мы имеем дело конечно с обратной функцией, во втором — с прямой. Это значит, что ускорение ритма деления (т. е. в конечном счете стимулирующее действие облучения) является фактором, уменьшающим число почек в препарате. C другой стороны, вовлечение новых клеток в преждевременное почкование ведет к увеличению числа почек в препарате. Ввиду этого, в зависимости от преобладания того или иного воздействия на клетки, можно получить перевес первого или второго из двух влияющих на число почек факторов. В случае явного перевеса влияния на ритм деления (т. е. его ускорения) и получается разбираемая нами теперь комбинация — дефицит числа почек и увеличение числа индивидуумов.

Итак, на основании этого рассуждения мы вправе снова сделать вывод, что подавляющее большинство опытов школы Гурвича, где положительный или отрицательный эффекты почкования являются выразителями соответственно митогенетической стимуляции или митогенетического угнетения, — должны быть подвергнуты сомнению.

"Ускорение ритма деления {т. е. в конечном счете стимулирующее действие облучения) является фактором, уменьшающим число почек в препарате. C другой стороны, вовлечение новых клеток в преждевременное почкование ведет к увеличению числа почек в препарате". Первое утверждение правильно и вполне согласуется с нашим анализом; второе заключение не доказано. Ведь при подсчете учитываются различные калибры почек, причем можно принять, что если расположить их по возрасту, то мы имеем дело приблизительно с продолжительностью в 15-20 мин. Таким образом, на протяжении 2—2,5 часа, во время которых мы получаем приблизительно одинаковый, даже, строго говоря, нарастающий эффект, мы можем в грубом приближении принять, что сменяется 8—10 поколений учитываемых почек, т. е. индукционный эффект (u — К), поддающийся учету, напр.,  14—10%), равен в действительности 30— 40%."

Нам непонятно, из чего может следовать нарастающий эффект, непонятны рассуждения относительно 8—10 поколений учитываемых клеток. Весь свой цикл клетка проделывает в  1¹/₂—2 часа. Время собственно почкования нам в точности неизвестно, но оно во всяком случае занимает не менее получаса — часа. Каким образом можно ожидать через  1¹/₂—2 часа после начала опытов прохождения 8—10 поколений?

C другой стороны, если бы и были эти 8—10 поколений, то разве можно по бароновскому методу учесть нарастающий эффект? Ведь считается-то не абсолютное число почек данного размера, а вычисляется отношение числа почек этого размера ко всем остальным формам.

Здесь нужно учесть, что увеличивается абсолютное число всех форм. Но тогда отношение может остаться без изменения.

4. Гурвич утверждает, что "число почек есть функция от двух переменных — длительности процессов почкования (т. е. темпа роста почек) и количества одновременно приступающих к почкованию клеток".

C этим нельзя согласиться. Во-первых, нас интересует не число почек вообще, а число почек определенного размера. Во-вторых, число почек в каждый данный момент есть функция, зависящая от целого ряда переменных — длительности периода покоя, длительности стадий почкования, после того как почка достигнет величины ^l/₃ материнской клетки, возможных стадий, когда после ускорения может быть некоторое замедление в развитии и т. д. Эти две переменные, о которых говорит Гурвич, не представляют независимых друг от друга переменных. Во всяком случае формула дается для абсолютного числа почек, а не для отношения почек определенного размера ко всем другим формам.

На основании всего сказанного нужно целиком согласиться со следующим положением А. Г. Гурвича:

"Если мы имеем дело с первоначальным митогенетическим эффектом, который послужил нам первым доказательством митогенетического излучения, то для каждого нового случая необходимо определенное доказательство или по крайней мере вероятность, что прирост числа митозов (почек) в препарате фактически соответствует стимуляции клеточного деления, так как абсолютно нельзя отрицать, что и при депрессивном воздействии на ход процесса деления, т. е. при торможении той или иной стадии деления, общее число митозов (почек), найденных на фиксированном препарате, может быть увеличено и, наоборот, при ускорении митозов их число на препарате уменьшено“.

C этим положением мы должны целиком согласиться с той оговоркой, что такие случаи будут не редким исключением, а по-видимому даже правилом.

А. Г. Гурвич утверждает, что число наблюдаемых митозов является функцией двух переменных: продолжительности митоза и длительности всего цикла жизни клетки, т. е. промежутка между двумя последующими делениями. Если мы обозначим первое через t, второе через Т, то вероятность застать данную клетку в митозе в данный момент равна t/(T+t).

Здесь необходимо сделать замечание.

При бароновском методе речь идет не об абсолютном числе почек, а об определенном отношении числа почек к  "взрослым" формам.

Какие же выводы напрашиваются?

1. Бароновская методика в отношении митогенетических лучей пока ни теоретически ни экспериментально не обоснована. Есть основания думать, что она дает извращенное представление о действительных процессах развития.

2. Так как методика сравнения скорости размножения по числу митозов (на луке, роговице глаза) принципиально сходна в ряде существенных моментов с бароновской дрожжевой методикой, то и она должна быть подвергнута сомнению.

3. Результаты всех опытов, проведенных с этой методикой, и теоретические выводы из них абсолютно ненадежны. Во всяком случае приходится брать под сомнение основное, а именно утверждение, что митогенетический луч ускоряет развитие. Скорее можно сделать обратное заключение — о торможении.

4.Этим мы не хотим ставить под сомнение самый факт существования митогенетических лучей. Если так часто получаются отклонения в проценте почек, числе митозов и т. д. в опытах по митогенетическим лучам, то естественно предположить здесь действие какого-то фактора помимо существующих в контроле. Решить все эти вопросы могут дальнейший тщательный математический анализ и соответствующие биологические исследования.

Напрашивается необходимость постановки следующих опытов.

1. На агар-агаре делается ровный засев термофильных дрожжей. Агар-агар разрезается на равные блоки. Контрольные дрожжи растут при комнатной температуре и в темноте. Опытные дрожжи растут на свету и при более высокой температуре. Подсчитывается через день-два в контроле и опытном материале по бароновскому методу разность скоростей почкования и одновременно подсчитывается абсолютное число особей.

Идея опыта ясна: мы вызываем светом и температурой, заведомо стимулирующими агентами, ускоренный рост дрожжей. Результаты таких подсчетов должны дать серьезный материал, если опыты будут проведены в достаточно большом количестве.

2. Аналогичные опыты нужно провести на тканях животных или растений для решения вопроса о показательности учета ускорения деления клеток по числу митозов.

3. Нужно провести при разных условиях подсчеты процентного отношения методом Барона почек не только меньших ¹/₃ материнской клетки, но и других размеров.

Сторонники бароновской методики должны провести целую серию продуманных экспериментов для доказательства своей правоты, иначе их работы, неубедительные для научных работников, не будут действенным оружием исследования для других, и сами они волей-неволей будут тормозить исследование актуальных вопросов, затрагиваемых их экспериментами. Перед работниками, занятыми проблемой клеточного деления, вырисовывается увлекательная загадка: являются ли клетки (в культуре дрожжей, в тканях) равноценными в смысле деления, какие имеются биологические закономерности взаимосвязи клеток, создающих, в частности, своеобразный эффект относительного постоянства (в контроле) процентного отношения почек определенного размера к другим формам.

На основании всего вышеприведенного ясно, что единственно правильным способом учета действительной скорости размножения, деления клеток, почкования дрожжей и т. д. является подсчет абсолютного числа особей. К этому переходит школа А. Г. Гурвича и несомненно тем самым делает положительный шаг.

Но как же оставлять нетронутым весь прежний 10-летиий материал, самую теорию митогенетического излучения?

Очевидно здесь мы имеем случай исключительного, чрезмерного, оптимизма исследователей.

¹Все предварительные математические соображения, приводимые в статье и оценка ряда положений школы А. Г. Гурвича являются результатом совместной работы автора с Э. С. Бауером.

ЛИТЕРАТУРА

1. Baron M.  Über mitogenetilsche Straheung bei Protisten, Arch. f. Entw. mech. Bd. 106., Roux. 1926. 2. Blacher L., Woronzowa M.,.Liosner L., und Samarajtev. Resorplionsprocesse als Quelle der Formbildung. VII, Die mitogenetischen Aussarhlungen als Stimulus des Wachstums des Vorderbeines bei der Metamorphose von Rana, Roux. Arch. f. Entv. wech. 1931. 3. Gurwitsch, A. Die mitogenetische Straheung. Berlin, Springer, 1932. 4. Maxia, O. Conferma del esistenza delle radiarzionie mitogenetiche del Gurvitsch dimostrata sul blastomeri di Paracentrotus lividus, Monit zool. ital. 5. Salkind S. Polozky A. und Zoglina. J. Die mitogenetische Beeinflussung der Eier von Prodsilus und Saccocirrus. Arch. mikr. Anat. Entw.-mech. 121. 6. Залкинд С. и Франк, Г. Митогенетические лучи. Госиздат, 121. 1930. 7. Schreiber und Nakaidzumi. Untersuсhungen über das mitogenetische Straheungsproblem. Biochern. Ztschr. Bd. 2 37. 1931. 8. Sewertzowa L., Influence du rayonnemen mitogentique sur  la vitesse de multiplication des bacteries. Ann. Inst. Pasteur. 46, 1926. 9. Tokin В. P. und Baranenkova A. S. Über Atherole und die Zellteilung. Biolog. Zentralbl. Bd. 50. H. 10. 1930. 10. Tokin B. P. Die mitogenetischen Strahlen (In Druck). 11. Tokin B. P. Neues Material über den Einfluss der aetheirischen Ole auf die Sprossung der Hefen Nadsonia fulvescens und auf die Furchung der Eier Mollusca physafontinalis L. (Im Druck).

Биол.  журн. Т. 2. Вып. 1. 1933. С. 3-19.